Nat Genet | 单细胞空间多组学揭示了 AREG-CXCL5-中性粒细胞轴在胆囊癌免疫治疗耐药中的关键作用

为了探究胆囊癌肿瘤微环境（TME）的异质性，，收集了 86 名胆囊癌患者样本（包括75 例腺癌、
、、、4 例腺鳞癌、、4 例神经内分泌肿瘤、、、、2 例未分化癌和 1 例鳞状癌）
、
、、、16 名无肿瘤患者的胆囊病变样本（包括9 例黄色肉芽肿性胆囊炎、、、4 例慢性胆囊炎、、2 例低度恶性病变和 1 例高度恶性病变）、、、2 个息肉样本、、11 个肝脏侵袭性病变样本、、不同组织的 20 个远处转移灶样本（12 个淋巴结、
、、6 个肝脏和 2 个网膜），，，总共135 个样本进行单细胞 RNA 测序（图 1a）。。。对189 个样本进行全外显子测序（WES）（图 1a）。。
。获得了 1,117,245 个细胞，，，，识别出了 11 种细胞类型和118 种亚型（图 1）。。。
 

对单核细胞
、、、巨噬细胞、、
、、中性粒细胞进行重聚类，，，，之后通过差异表达分析、、SCENIC、、、基因特征评分及Ro/e分析，，，识别出了5种具有不同功能的细胞亚型，，如N_C0_MNDA
、、N_C1_ISG15、、、、N_C2_CCL3L1、、N_C7_MNDA_S100A8、、、N_C9_S100A10（图 2a–g）
。。。值得注意的是，，伪时间分析表明，，，，N_C0_MNDA 和 N_C7_MNDA_S100A8 是最先被招募的中性粒细胞亚型（图 2c、、d）。。根据临床诊断将Adeno_Pri（原发性腺癌）分为Adeno_Pri (P)和转移性Adeno_Pri （P_Mets），，，并发现几乎所有常见的中性粒细胞亚型在 P_Mets 组中均显著增多（图 2h、
、i）
。。。
。

鉴于 N_C0_MNDA 和 N_C7_MNDA_S100A8 是肿瘤相关中性粒细胞（TANs），，，进一步通过CellChat发现多种巨噬细胞亚型参与了中性粒细胞的募集，，，且趋化因子在巨噬细胞亚型（M_C0_FOLR2 和 M_C2_SPP1）中显著上调（图 2j、、、
、k）
。。。。巨噬细胞亚型（M_C0_FOLR2 和 M_C2_SPP1）中 CXCL2
、、、CXCL3 和 CXCL8随着 TNM 分期呈现逐渐升高的趋势（图 2l）
。
。与 N_C0_MNDA 和 N_C7_MNDA_S100A8不同，，
，N_C7_MNDA_S100A8 表现出更高的中性粒细胞外陷阱（NETs）评分（图 2m-p）。。与CellChat结果一致，，，CODEX 技术检测到了中性粒细胞和巨噬细胞之间的空间接近关系（图 2p）
。。这些结果表明巨噬细胞可能招募早期浸润的中性粒细胞亚型（N_C0_MNDA 和 N_C7_MNDA_S100A8）
，，随后在肿瘤微环境的诱导下分化为 TAN 亚型，，最终形成富含促转移性 TAN 的腺癌微环境。
。
。

将 13,571 个树突状细胞分为八个亚群，，，，其中七个常见细胞亚群被用于后续分析（图 1e）。。
。。大部分DC亚型在Adeno_Pri中减少（图 3a-e）。。。DC_C4_PPP1R14A_cDC2 在 P_Mets 组中最丰富（图 3f）。。DC_C4_PPP1R14A_cDC2 是脂质抗原呈递 DC 细胞，，，且CD1A 在疾病进展中表现出显著增加（图 3g-k）。
。。。细胞间互作分析显示，，，DC_C4_PPP1R14A_cDC2 通过 ANXA1-FPR1与髓系亚型（尤其是 M_C1_S100A8）相互作用（图 3l，，，m）。。。。CODEX验证了这两个亚型在空间上彼此靠近，
，表明 DC_C4_PPP1R14A_cDC2 可能通过 ANXA1-FPR1 招募 M_C1_S100A8（图 3n）。。这些结果表明 DC_C4_PPP1R14A_cDC2 具有脂质抗原呈递细胞的特性，，，，DC_C4_PPP1R14A_cDC2 可能通过 ANXA1–FPR1 招募 M_C1_S100A8。。
。。
 

将 CD8 T 细胞、、CD4 T 细胞、、NK细胞、、、B 细胞和浆细胞分别聚类为 10 种、、8 种、、、、8 种、、5 种和 2 种常见亚型（图 1e）。。
。。在Adeno_Pri中大量存在的CD8T_C1_CXCL13_TEX 在早期阶段表现出增强的细胞毒性及免疫检查点活性，，，，但从 IIIB 到 IVB 状态则表现出细胞毒性减弱，，表明晚期中其状态已转变为耗竭状态（图 4a-c）。。。功能的转变可能通过 CD86-CTLA4 与 M_C1_S100A8 的相互作用来调节，，这一点通过细胞互作分析和 CODEX 得到了证实（图 4d
、、、e）。。。

此外，
，
，发现富集于 P_Mets 的 CD4T_C2_CCR7_TN 细胞高表达 AREG 和Naive标志物（IL7R）（图 4f、、、、g）。。
。随着疾病的发展
，，，Adeno_Pri 中 CD4T_C2_CCR7_TN 的 AREG 表达和比例逐渐增加，，同时伴有与 TNM 分期相关的动态功能变化（图 4h、
、、i）。
。。在不同类型的转移中，
，，，CD4T_C2_CCR7_TN 在 Adeno_LN 中最为常见
，，，，AREG 的表达仅在腺瘤性淋巴结中被检测到（图 4j-l）。。AREG 仅在胃癌、
、、肝内胆管癌和远端胆管癌naive CD4+ T cells中表达（图 4m-p）。
。GO富集分析表明IL-10 信号通路在CD4T_C2_CCR7_TN中上调，，，表明可能调节免疫激活（图 4q）。。。综上所述，
，，CD4T_C2_CCR7_ TN在P_Mets富集，
，，其特征是 AREG 高表达。。。

为了进行疾病分层
，，选择了随着疾病进展显著变化的亚型对腺癌患者进行分层，，，获得了5种TME分层（MI1–MI5）（图 5a
、、、b）。。。预后分析显示
，，，，晚期样本富集的 MI2 表现出临床效果不佳（图 5c）。。。公共数据库bulk RNA-seq数据也表明MI2 富集的患者预后不良，，，且MI2 特定细胞亚型（CD8T_C0_CCR7_GZMK_TCM
、、
、、CD8T_C12_TRDC_γδT 和 CD4T_C2_CCR7_TN）也显著富集（图 5e、
、
、f）。。。。综上所述
，，MI2 中独特的淋巴细胞亚型可能是其预后表现的关键因素。。。

为了识别肿瘤细胞亚型，，，作者提出了一种名为 AI-EPI 的计算方法（图 6a）
。。。
。获取了七个患者共有的基因模块（GMs，，如GM8、、GM1、
、GM16、、、、GM5
、
、、GM3、
、、、GM7、、GM6），，并基于共有的 GMs 将肿瘤细胞分为了不同的细胞状态（图 6b–d）。。。进一步分析发现 GM16 在 P_Mets 中得分更高，
，，在 IIIB 期中得分最高（图 6e、、、、f）
。。
。。肿瘤异质性与 GM16 得分也表现出强相关，，，，GM16高得分样本表现出不良预后（图 6g、、、h）。。

为了探究 GM16 与富含 P_Mets 的细胞亚型之间的空间相互作用，
，
，对 GM16 评分较高的2个样本进行了空间转录组测序
。。。。GM16 与这些细胞亚型（B_C0_IGHA1
、
、M_C1_S100A8、、DC_C4_PPP1R14A_cDC2、、
、CD4T_C2_CCR7_TN
、、、
、CD8T_C0_CCR7_GZMK_TCM）具有较高的空间相关性（图 6i）。。这一发现也得到了细胞互作分析的支持（图 6j）。。。。总之，，，GM16与多种富集在P_Mets中的免疫细胞亚型（包括B细胞、、、、巨噬细胞、
、
、树突状细胞、、CD4+T细胞和CD8+T细胞）存在显著的空间共定位，
，，，表明这些免疫细胞倾向于聚集在GM16肿瘤细胞周围，，，，形成一个紧密的“合作”网络。。。

进一步发现 AREG 仅在与 GM16 接近的细胞亚型中表达（如CD8T_C0_CCR7_GZMK_TCM、、、 CD4T_C2_CCR7_TN、、DC_C4_ PPP1R14A_cDC2、、、、M_C1_S100A8 和 B_C0_IGHA1），，，
，而在远离 GM16 的内皮细胞
、
、、、成纤维细胞和中性粒细胞亚型中未表达（图 7a）。。AREG 不仅在巨噬细胞
、、、B 细胞和 T 细胞中表达
，
，还在上皮细胞中表达（图 7b）。。。为了进一步探究在 AREG 刺激下肿瘤细胞的功能变化，
，对AREG 处理的 GBC-SD 细胞进行RNA-seq分析，
，
，发现CXCL5 显著上调（图 7c-e）。
。
。鉴于 AREG 是 EGF 家族的一员，，，
，因此推断 AREG 可能 EGFR 调节 CXCL5 的表达。。。湿实验结果表明anti-EGFR处理抑制了这一效应（图 7f-i）。
。。
。此外
，，体内外实验证实，，AREG 不仅促进肿瘤转移
，，，，还通过EGFR-pERK-EGR1 信号通路上调肿瘤细胞 CXCL5 的表达，，招募中性粒细胞浸润，
，进而削弱免疫治疗（如 PD-L1 抗体）的疗效（图 7l-r）。
。这些结果表明，，AREG 通过 EGFR–pERK–EGR1上调CXCL5来促进胆囊癌转移。。

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