双萤光素酶检测



双萤光素酶报告系统介绍

双萤光素酶检测实验中的双萤光素酶包含两种，，，
，一种是作为报告基因的萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase简称F-Luc），，，另一种是作为内参的海肾萤光素酶（Renilla luciferase简称R-Luc），
，，，两种萤光素酶的底物和辅因子不同。。F-Luc需要萤光素、、
、、氧气、、、ATP、、
、镁离子等，
，发光颜色黄绿色，，，波长550-570nm；R-Luc仅需要腔肠素和氧气，，，波长480nm。。。在细胞中同时表达F-Luc和R-Luc
，，，，F-Luc作为报告基因反应目的基因表达的改变，，
，R-Luc作为内参基因，，，为试验提供一基准线（减少内在变化因素如培养细胞的数目，，，细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响）。。。。所构成的报告系统广泛用于靶基因验证和启动子活性的研究
。。。
。





应用介绍

靶基因验证
miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻译），，，
，将目的基因3’UTR（野生型和结合位点突变型）序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端，
，，，通过比较过表达miRNA后
，，，，报告基因表达的改变（萤光素酶的活性下降还是不变），，，，来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
。。
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启动子活性研究
转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用，，，将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子
，，，，通过共表达转录因子后
，，报告基因表达的改变
，，来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。。。。



技术路线

根据实验目的设计实验方案—预测结合位点--构建野生/突变报告基因载体系统---共转染细胞---检测酶活



常见应用方向总结

（1）验证miRNA同mRNA靶向互作。。。。将靶mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，，
，再共转入该miRNA
，，
，，如果萤光素酶活性下降，
，，，则提示为其靶序列。。。 

（2） 验证miRNA同circRNA靶向互作。。。将circRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，，，，检测萤光素酶活性。。。 

（3） 验证miRNA同lncRNA靶向互作。。将lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，，检测萤光素酶活性。。

（4）启动子活性分析
。。。将启动子区域序列进行分段截短，
，
，，再分别构建入报告基因载体，
，，
，检测其启动子活性
。。

（5） 验证特定转录因子同启动子的作用。。。将启动子区域插入报告基因载体，，同时在实验细胞中共转该转录因子，，，分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。。 

（6）分析信号通路是否激活。
。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，，
，在不同上游信号条件下，，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。。。
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